著者の所属・活動拠点の国は、ポルトガルです。

掲載誌：Molecules

ライセンス: CC BY　対象: 公開論文　確認元: OpenAlex

研究の目的

ワインづくりでは、ぶどうを潰して搾った果汁（マスト）の濁りを取り除く「清澄化」が重要な工程です。濁りの主な原因は、ぶどうの細胞壁に由来するペクチンなどの大きな多糖類です。これらが液中に細かく分散するため、沈殿やろ過がしにくくなります。そこで、ペクチンを分解する酵素（ペクチナーゼ）を加えることが広く行われています。特にロゼワインは短時間の醸し（果皮との接触）を経るため、白ワインのマストより濁りやすく、清澄化が難しいとされます。

産業では、酵素はふつう液に直接溶かした「遊離」の状態で使われます。しかしこの使い方では、酵素の安定性が不十分なうえ、使用後に回収して再利用することも困難です。対策として、酵素を固体の担体に固定する「固定化」があります。著者らによると、ナイロンの一種であるポリアミドはこれまでもペクチナーゼの担体として使われてきました。ただし、多くはグルタルアルデヒドなど毒性のある薬剤で活性化して酵素を化学結合させる方法で、食品分野での利用には制約がありました。また、市販の液体酵素製剤は複数の酵素が混ざっており、組成が公開されていません。そのため、固定された量や働きを正確に評価しにくいという問題もありました。

研究チームは、性質のはっきりした凍結乾燥ペクチナーゼ（主成分はポリガラクツロナーゼ）を、多孔質のポリアミド6（PA6）微粒子に吸着させて固定する方法を検討しました。目的は、固定化の条件を液の酸性度（pH）と酵素濃度で改善すること、得られた固定化酵素の性質を調べること、そして実際の工業用の白ワイン用・ロゼワイン用マストの清澄化に使えるかを評価することでした。

何を、どのように調べたか

担体には、直径25〜45マイクロメートル程度で、350〜600ナノメートルほどの細孔をもつPA6微粒子を用いました。100ミリグラムの微粒子に酵素溶液5ミリリットルを加え、室温で24時間ゆるやかに振とうし、酵素を物理的に吸着させました。化学結合のための活性化剤は使っていません。酵素溶液のpHは、クエン酸やリン酸の緩衝液で調整しました。固定された量は、吸着後に液中に残った酵素を紫外線の吸収で測り、差し引いて求めました。

まずpH 7で、酵素濃度を1ミリリットルあたり0.5ミリグラムと1.0ミリグラム（担体1グラムあたり25ミリグラムと50ミリグラム）にして比べました。続いて、0.5ミリグラムの濃度でpHを5から8まで変えて固定化しました。得られた固定化酵素は、熱分析や、酵素のたんぱく質構造を調べる分光測定などで評価しました。

酵素の働き（活性）は、ペクチンを分解して生じる糖の量から測りました。マストや発酵中の液には糖やエタノールが含まれるため、ブドウ糖（5〜15%）やエタノール（5〜15%）を加えた条件での活性も、遊離酵素と固定化酵素の両方で調べました。さらに、酵素が基質（ペクチン）とどれだけ結びつきやすいかを表すKm値と、最大反応速度Vmaxを求めました。Km値は大きいほど結びつきにくいことを意味します。

実用試験では、ペクチンを1ミリリットルあたり2.0ミリグラム含む工業用の白ワイン用マスト（pH 3.19）とロゼワイン用マスト（pH 3.44）を用いました。室温で、遊離酵素0.1ミリグラムと、これに相当する量の固定化酵素とで清澄化を比べました。あわせて、色の濃さや色調、褐変の程度、ポリフェノール類の量といった色・成分の指標も測りました。最後に、固定化酵素を洗って繰り返し使う試験を5回行い、4℃での保存による活性の変化を最長4か月追跡しました。

主な報告結果

固定化酵素は、実際の白ワイン用・ロゼワイン用マストの清澄化に使えました。遊離酵素よりやや長い時間を要したものの、PA6微粒子によって好ましくない色の変化は起きず、マストの色やフェノール成分は保たれたと報告されています。

繰り返し使用では、活性の測定試験において、1回目の後に活性が大きく下がりました。その後は5回目まで初回の30〜40%程度で比較的安定していました。最も成績がよかったのはpH 7で固定化したもので、5回目の終わりに初回の約35%の活性を保っていました。著者らは、最初の低下は結合の弱い酵素の一部が担体から外れたためと考えています。実際のマストを用いた再利用については、2回連続の使用で産業的に実用可能だったとしています。

固定化の条件では、酵素濃度を1ミリリットルあたり0.5ミリグラムから1.0ミリグラムに倍増しても、固定化された割合（固定化収率）は26〜29%でほぼ変わりませんでした。このことから、0.5ミリグラムの時点で担体の吸着量が飽和に近いと考えられました。一方、濃度を0.5ミリグラムより下げると、収率は10〜13%にとどまりました。pHの影響は大きく、収率はpH 5で最も低く、pH 7で最も高くなりました。構造の測定では、酵素はpH 6〜7で最も安定な構造を示しました。

糖とエタノールの影響もはっきり分かれました。ブドウ糖を5%加えると、遊離酵素・固定化酵素ともに活性が約20〜30%下がりましたが、10〜15%に増やしてもそれ以上の大きな低下は見られませんでした。逆にエタノールを5%加えると、活性は加えない場合より約10〜45%高まりました。10%や15%では5%のときより下がったものの、加えない場合よりは高いままでした。

反応の性質を調べると、固定化によってKm値が大きく上がりました。たとえばpH 5で固定化した場合、1ミリリットルあたり0.654ミリグラムから2.814ミリグラムに増えています。一部の条件ではVmaxが上がりましたが、VmaxをKmで割った触媒効率は遊離酵素のほうが高くなりました。著者らはこの理由を、ペクチン分子が微粒子の細孔の奥にある酵素まで届きにくいためだと説明しています。

4℃での保存では、4週間後に遊離酵素・固定化酵素ともに初めより高い活性を示しました（過剰活性化と呼ばれる現象）。この時点では、固定化酵素がいずれも対応する遊離酵素を上回り、pH 7で固定化したものが最も高い活性でした。一方、4か月後にはすべて初めの活性を下回りました。pH 6とpH 8で固定化したものを除き、固定化酵素の活性は遊離酵素より低くなりました。

この報告が示すこと

研究チームは、単純な吸着の手順でペクチナーゼを固定でき、PA6微粒子がペクチナーゼの丈夫で有効な担体になると結論づけています。酵素がエタノールを含む液にもよく耐えることから、固定化酵素はワイン加工の環境に適しているとしています。保存については、遊離酵素より高い活性を保つため、固定化後2〜3週間以内の使用を推奨しており、前もって準備して保存しておける点は産業利用の利点になると述べています。

一方で著者らは、繰り返し使用で活性が徐々に失われる仕組みについて、担体から酵素が外れることや、酵素が元に戻らない形で働きを失うことの関与を含め、詳しくは調べられていないと述べています。また、遊離酵素と固定化酵素の比較は、今回の条件での触媒としての性能と反応の性質に主に絞られていたことも、限界として挙げています。

原著論文の著者・所属：Sandra C. Oliveira（IPC—Institute for Polymers and Composites, Campus of Azurém, University of Minho, 4800-058 Guimarães, Portugal）、Nadya V. Dencheva（IPC—Institute for Polymers and Composites, Campus of Azurém, University of Minho, 4800-058 Guimarães, Portugal）、Zlatan Z. Denchev（IPC—Institute for Polymers and Composites, Campus of Azurém, University of Minho, 4800-058 Guimarães, Portugal）

※本記事は原著論文をもとに、日本語で要約・説明を加えた研究紹介です。 出典（原著論文）：Sandra C. Oliveira, Nadya V. Dencheva, Zlatan Z. Denchev. Pectinase Immobilization on Porous Polyamide Microparticles: Characterization, Operational Stability and Application in Wine Clarification. Molecules（出版社：Multidisciplinary Digital Publishing Institute） 2026-08-21. DOI: 10.3390/molecules31162930. 原著ライセンス：CC BY.