著者の所属・活動拠点の国は、イタリアです。

掲載誌：Marine Drugs

ライセンス: CC BY　対象: 公開論文　確認元: OpenAlex

研究の目的

テトロドトキシン（TTX）は、神経や筋肉の細胞にある「電位依存性ナトリウムチャネル」というナトリウムの通り道をふさぐ強い神経毒です。魚介類を食べた人の中毒の原因となり、消化器や神経の症状に始まり、重い場合は呼吸不全で死に至ることがあります。フグの毒として知られてきましたが、細菌がつくると考えられており、二枚貝や巻貝、甲殻類など多様な生物から見つかっています。近年はヨーロッパ沿岸、特に地中海からも報告が増えており、イタリアでは2016年にシチリアのムール貝で初めて報告されました。2017年以降は、主にアドリア海の二枚貝で見つかっています。

EU加盟国でTTXを公式の貝毒監視に組み込んでいるのはオランダだけです。同国は、欧州食品安全機関（EFSA）が勧める貝の身1kgあたり44μgという安全の目安を採用しています。著者らによると、質量分析などの機器分析は毒の種類を正確に特定できますが、費用と時間がかかります。また、毒性の強さが異なる類縁の毒が混ざっている場合、量を測るだけでは試料の実際の毒性は分かりません。そこで注目されるのが、マウス由来の神経芽細胞腫細胞「Neuro-2a」を使い、毒の作用そのものを測る細胞検査です。ただし、この検査は研究室ごとに条件がばらばらで統一された手順がなく、ムール貝の成分が測定に与える影響もほとんど調べられていませんでした。研究チームは、この検査の条件を最適化し、ムール貝のTTXを定量するための標準手順を示すとともに、その性能を同じ研究室内で検証することを目指しました。

何を、どのように調べたか

この検査では、ナトリウムを細胞に過剰に流れ込ませて細胞死を起こす2種類の薬剤（論文ではO/Vと表記）を使います。TTXがあるとナトリウムの通り道がふさがれるため、細胞は死をまぬがれます。生き残った細胞の量は、生きた細胞だけが色素を作る「MTT法」で測ります。生き残る細胞が多いほど、試料中のTTXが多いと判断できます。

研究チームは、従来の報告で統一されていなかった4つの条件を検討しました。1つ目は1区画あたりにまく細胞の数で、1000〜5万個の範囲を比べました。ほかに培養液の種類（RPMI-1640とMEM）、MTT法の手順、O/Vの濃度の組み合わせを検討しました。O/Vは文献に基づく4通りの組み合わせを比べています。

最適化した手順については、まずTTX溶液を使い、同じ日の中と、6か月の間に複数の担当者が行った場合の測定のばらつきを確かめました。次に、TTXと同じ作用を持つサキシトキシン（STX）と類縁体の4,9-アンヒドロTTXを測り、作用の異なる7種類の海洋毒素が検出に紛れ込まないかも調べました。さらに、毒を含まないムール貝の抽出液を段階的に薄め、既知量のTTXを加えました。こうして貝の成分が測定を乱さない薄め方を探し、検出できる最低濃度（検出限界）と正確に量を示せる最低濃度（定量限界）を国際的な指針に沿って求めました。

最後に、北アドリア海のヴェネツィア潟とマラーノ潟の計4地点で、2023〜2025年の5〜10月に採取したムラサキイガイ25試料を分析しました。結果は、基準法とされる質量分析（LC-MS/MS）の結果と比べました。

主な報告結果

野外で採取したムール貝の分析では、両方の方法とも25試料のうち6試料でTTXを検出しませんでした。質量分析で身1kgあたり11〜49μgのTTXが測られた11試料は、細胞検査の定量限界を下回りました。残る8試料では、細胞検査の値が身1kgあたりTTX相当量で67.8〜176.6μgでした。これは質量分析の58〜196μgに近く、両者の相関係数は0.9875と非常に強い一致を示しました。質量分析では、これらの試料からTTX以外の類縁体やSTXは検出されませんでした。

ムール貝の抽出液は、100倍に薄めると測定への妨害が見られなくなりました。この条件での検出限界は0.162ng/mL、定量限界は0.540ng/mLでした。貝の身に換算すると、それぞれ1kgあたり16.2μgと54μgです。EFSAの目安44μgと比べると、検出限界は目安より低く、定量限界はわずかに高い値です。既知量を加えた試料での測定値のずれ（バイアス）は平均10.7%でしたが、最も低い濃度（0.44ng/mL）では44.3%と大きくなりました。

条件の検討では、まく細胞を1区画あたり5000個とするのが適切だと分かりました。これより多いと測定値が細胞数に比例しなくなり、1000個では信号が背景とほぼ区別できなかったためです。O/Vの濃度は0.27/0.027mMが採用されました。TTX溶液での測定は直線性がよく、ばらつきを示す値（相対標準偏差）は同じ日の中で15%、6か月間で11%でした。

STXはTTXと同様に検出され、1.23ng/mLと3.7ng/mLでは、TTXより強く細胞を守りました。一方、4,9-アンヒドロTTXはほとんど検出されませんでした。どちらも、ナトリウムの通り道をふさぐ力の強弱と一致する結果だと著者らは説明しています。作用の異なる毒素のうち、それ自体が細胞を傷つけなかったアザスピロ酸-1と2種類のシガトキシンは、検査で検出されませんでした。

この報告が示すこと

研究チームは、統一されていなかったNeuro-2a検査の条件を定め、ムール貝のTTXを測る標準的な手順を示しました。この検査は毒の量ではなく、ナトリウムの通り道をふさぐ働きの強さを、TTXに換算した値として示します。そのため、毒性の異なる類縁の毒が混ざっていても、試料全体として潜在的にどれほど有毒かを見積もれるのが利点だと著者らは述べています。結論としては、基準法である質量分析を補う、ムール貝の安全性評価のための有望なふるい分け（スクリーニング）検査と位置づけています。

限界として、著者らは次の点を挙げています。今回の検証は1つの研究室内で行われたもので、別の研究室でも同じ結果が得られるかは、研究室間の検証で確かめる必要があります。また、EFSAの目安に近い低い濃度域では、量を測る正確さが十分ではありません。さらに、それ自体が細胞を傷つける別の毒素が混ざる可能性があるため、O/Vを加えずに試料の毒性を並行して調べることで対処できるとしています。

原著論文の著者・所属：Alessandra D’Arelli（Department of Life Sciences, University of Trieste, Via A. Fleming 22, 34127 Trieste, Italy）、Silvio Sosa（Department of Life Sciences, University of Trieste, Via A. Fleming 22, 34127 Trieste, Italy）、Sonia Dall’Ara（National Reference Laboratory for Marine Biotoxins, Fondazione Centro Ricerche Marine, V.le A. Vespucci 2, 47042 Cesenatico, Italy）、Monica Cangini（National Reference Laboratory for Marine Biotoxins, Fondazione Centro Ricerche Marine, V.le A. Vespucci 2, 47042 Cesenatico, Italy）、Michela Carlin（Department of Life Sciences, University of Trieste, Via A. Fleming 22, 34127 Trieste, Italy）、Pietro Antonelli（Laboratory of Microbial Ecology and Genomics, Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Viale dell’Università 10, 35020 Legnaro, Italy; PhD National Programme in One Health Approaches to Infectious Diseases and Life Science Research, Department of Public Health, Experimental and Forensice Medicine, University of Pavia, 27100 Pavia, Italy）、Aurora Dall’Occo（Laboratory of Microbial Ecology and Genomics, Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Viale dell’Università 10, 35020 Legnaro, Italy）、Nicolas Scapin（National Reference Center for fish, Mollusc and Crustacean Diseaseas, Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Viale dell’Università 10, 35020 Legnaro, Italy）、Giuseppe Arcangeli（National Reference Center for fish, Mollusc and Crustacean Diseaseas, Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Viale dell’Università 10, 35020 Legnaro, Italy）、Carmen Losasso（Laboratory of Microbial Ecology and Genomics, Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Viale dell’Università 10, 35020 Legnaro, Italy）、Aurelia Tubaro（Department of Life Sciences, University of Trieste, Via A. Fleming 22, 34127 Trieste, Italy）、Marco Pelin（Department of Life Sciences, University of Trieste, Via A. Fleming 22, 34127 Trieste, Italy）

※本記事は原著論文をもとに、日本語で要約・説明を加えた研究紹介です。 出典（原著論文）：Alessandra D’Arelli, Silvio Sosa, Sonia Dall’Ara, et al. Optimization and Intra-Laboratory Validation of the Neuro-2a Assay for Tetrodotoxin Detection in Mussels. Marine Drugs（出版社：Multidisciplinary Digital Publishing Institute） 2026-09-08. DOI: 10.3390/md24090314. 原著ライセンス：CC BY.