著者の所属・活動拠点の国は、中国です。

掲載誌：Plants

ライセンス: CC BY　対象: 公開論文　確認元: OpenAlex

研究の目的

サトウキビは世界の砂糖の約8割、バイオエタノールの約4割を支える作物です。一方で、病害虫や環境ストレスが収量や糖の蓄積を妨げています。ゲノムが非常に複雑で育種に時間がかかるため、ストレスに強い遺伝子を優良品種に導入する遺伝子工学に期待が寄せられています。しかし、現在主流の遺伝子導入法は、カルス（培養で増やした未分化な細胞の塊）から植物体を再生させる組織培養に大きく依存しています。そのため数か月を要し、再生しにくい品種が多いうえ、培養中に意図しない変異が生じることもあるのが課題でした。

そこで研究チームは、組織培養を経ずに生きた植物体へ直接遺伝子を入れる「インプランタ形質転換」を、サトウキビで簡便かつ効率よく行う方法の確立を目指しました。さらに、この方法の実用性を確かめるため、植物の防御物質であるクロロゲン酸の合成に関わるとみられる遺伝子Sh4CL13を導入し、その働きを調べました。クロロゲン酸は、チョウ目の害虫などに対して生育阻害作用が報告されている化合物です。Sh4CL13がつくる酵素「4CL」は、その合成経路の要となる段階を担うとされています。

何を、どのように調べたか

材料には、葉が2枚出た段階のサトウキビの苗を使いました。予備実験で、この段階の苗は成長点の活性が最も高く、傷口の壊死が最も少なかったためです。苗の先端の成長点付近を約0.5センチ切り取り、遺伝子の運び役となる細菌アグロバクテリウムの懸濁液をピペットの先で傷口に45分間当てました。その後、傷口をフィルムで覆って暗所に置き、3日後に同じ操作を繰り返しました。さらに抗生物質ハイグロマイシンで選抜を行い、一定期間暗所で管理してから通常の光条件に戻しました。

導入の目印には、成功すると赤い色素ができるはずの標識遺伝子RUBYを使いました。新しく伸びた葉からDNAを取り出し、PCR（特定のDNA断片を増やして検出する方法）で導入遺伝子が入っているかを確認しました。効率に影響する条件として、細菌の濃度（OD600という濁り度で0.3、0.5、0.7）、暗所処理の期間（1、2、3週間）、感染処理の回数（1、2、3回）の三つを順に比べました。各条件は苗50本を1組として3反復で行いました。最適化した条件は、8品種のサトウキビにも適用しました。

続いて、Sh4CL13の遺伝子全体を単離し、配列を解析しました。そのうえで、改良した方法を用いて品種FN91-4621にこの遺伝子を過剰に働かせる形で導入しました。比較対象は、遺伝子を載せていない空のベクターを導入した株と、何も導入していない野生型株です。遺伝子の発現量とクロロゲン酸の含量を測定したほか、害虫アワヨトウの孵化直後の幼虫を各葉で個別に飼育しました（1処理15匹、3反復）。そして、発育期間、蛹化率、蛹の重さ、羽化率を記録しました。

主な報告結果

三つの条件を比べた結果、最も効率が高かったのは、細菌濃度OD600=0.5、暗所処理2週間、感染2回の組み合わせでした。細菌濃度では、0.5のときの効率が46.0%で、0.3（20.0%）や0.7（26.0%）を有意に上回りました。暗所処理では、2週間で51.2%となり、1週間（7.3%）や3週間（17.6%）を大きく上回りました。感染回数では、2回が44.6%で、1回（13.0%）や3回（13.3%）より有意に高い値でした。なお、ここでの効率は、PCRで導入遺伝子が検出された苗の割合です。

この最適条件を8品種に適用したところ、すべての品種で導入に成功し、効率は33.3〜51.3%でした。品種の特定の農業形質と効率の間に、目立った関係は見られませんでした。一方、PCRでは導入が確認されたにもかかわらず、RUBYによる赤い色は目で見て分かるほどには現れませんでした。

Sh4CL13は1641塩基からなり、547個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしていました。4CL酵素に共通する保存領域も備えていました。この遺伝子を導入した株では、空ベクター株と比べて遺伝子の転写量が3.25倍、葉のクロロゲン酸含量が13.7倍に増えました。導入株の葉を食べたアワヨトウ幼虫は発育期間が32.1日に延び、空ベクター株や野生型株の葉を食べた幼虫と比べて、蛹の重さと羽化率が有意に低下しました。蛹になる割合には有意な差がありませんでした。

この報告が示すこと

研究チームは、2葉期の苗を使い、簡便で効率がよく、品種に左右されにくいサトウキビのインプランタ形質転換法を確立したと結論づけています。この方法は組織培養を必要とせず、培養に伴う変異を避けられます。また、先行研究の茎片を使う方法（効率32.6%）で用いられた超音波処理や真空処理の装置も要りません。感染から分子検出までは4〜6週間で済むとしています。さらに、この方法を用いた実験から、Sh4CL13がクロロゲン酸を介した害虫への防御に促進的な役割を果たすと結論づけています。

一方で、著者らは限界も挙げています。効率はPCRによる検出に基づいており、陽性の株の中には、遺伝子が一時的に働いているだけのものや、導入された細胞とされていない細胞が混ざった「キメラ」の個体も含まれうるとしています。安定して遺伝子が組み込まれたかを確かめるには、サザンブロット解析や次世代での遺伝の仕方の分析が必要だと述べています。赤い色が見えなかった理由についても、キメラ個体の中で色素がわずかしか作られず、目に見える量に達しなかった可能性を推測として挙げるにとどめています。また、クロロゲン酸の合成には律速となりうる段階が他にもあります。そのため、Sh4CL13の発現をさらに高めれば含量も比例して増えるかどうかは、今後の検討課題とされています。

原著論文の著者・所属：Yue-Han Zhao（National Engineering Research Center of Sugarcane, Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China）、Lin Li（National Engineering Research Center of Sugarcane, Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China）、Ya-Li Wu（National Engineering Research Center of Sugarcane, Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China）、Hai-Tao Zhao（National Engineering Research Center of Sugarcane, Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China）、Hua-Ying Fu（National Engineering Research Center of Sugarcane, Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China）、San-Ji Gao（National Engineering Research Center of Sugarcane, Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China）、Jin-Da Wang（National Engineering Research Center of Sugarcane, Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China）

※本記事は原著論文をもとに、日本語で要約・説明を加えた研究紹介です。 出典（原著論文）：Yue-Han Zhao, Lin Li, Ya-Li Wu, et al. Development of an Optimized in Planta Transformation System in Sugarcane and Its Application on Sh4CL13 in Chlorogenic Acid Biosynthesis. Plants（出版社：Multidisciplinary Digital Publishing Institute） 2026-08-17. DOI: 10.3390/plants15162489. 原著ライセンス：CC BY.